1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种: 白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231)，购自中国医学菌种保藏中心。
1.1.2 培养基与试剂: 沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)、RPM-1640液体培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YEPD)；蛋黄培养基；紫草素标准品购于成都曼斯特股份有限公司。
1.1.3 主要实验仪器设备: 酶标仪(Thermo MULTISKAN ASCENT)；PCR仪(英国TTECHNE-512型)；实时荧光定量PCR仪(日本TAKARATP800)；电泳凝胶定量分析系统(Bio-Rad公司，Version 3.1)；扫描电镜(KYKY-1000B)；激光共聚焦显微镜(Zeizz LSM 710，German)。
1.2 紫草素对白色念珠菌的抑制作用测定
将200 µL培养至对数期的白色念珠菌的菌悬液(106 CFU/mL)分别加入96孔板中，再加入20µL不同浓度的紫草素药液，使其终浓度分别为64、32、16、8、4μg/mL，37℃培养24h后于595 nm处测定吸光值。以不加药物组为空白对照。实验重复3次，取平均值。其中，紫草素对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)值为菌体的OD值下降80%以上的最低药物浓度。从大于MIC的各孔中分别取10µL菌悬液涂布于SDA固体培养基上，37℃培养48h后观察菌体生长情况，最低杀菌浓度(MFC)为平板上没有菌体生长的最低药物浓度。
1.3 紫草素对白色念珠菌细胞膜渗透性的影响
将培养至对数期的菌悬液按2%接种量接种于20mL RPM-1640液体培养基中，以150r/min、30℃恒温培养16h后，离心弃上清液，用PBS洗涤菌体2次，制成适当浓度的白色念珠菌菌悬液，分别向其中加入浓度为MIC和2MIC的紫草素继续培养12h，每隔2h分别取样液4mL，4000r/min离心10min弃沉淀，用紫外分光光度计于260nm下测定上清液中DNA和RNA等大分子物质的变化。以不加药为空白对照组，实验重复3次，取平均值。
1.4 紫草素对白色念珠菌形态的影响
将培养至对数期的白色念珠菌菌悬液(107 CFU/mL)接种于含紫草素终浓度为MIC的YEPD液体培养基中，150r/min、30℃振荡培养。于6h和16h分别取1mL菌悬液，3000r/min离心5min后弃上清。再加入0.5mL PBS缓冲液和0.5mL 2.5%的戊二醛，4℃冰箱固定过夜。次日用PBS缓冲液冲洗2次，50%、80%、100%乙醇依次脱水1次，每次15min，100%乙醇浸没的电镜样品置4℃冰箱中降温10min后，放入真空干燥器中干燥40min。待干燥后的样品温度升至室温后取出，喷金镀膜，使用扫描电镜观察照相，以不加药组为空白对照，实验重复3次。
1.5 紫草素对白色念珠菌细胞内钙离子浓度的影响
将2mL RPM-1640培养基及300μL培养至对数期的菌悬液(106CFU/mL)分别加入6孔板中，每孔内分别放一片无菌盖玻片，37℃培养4h后，以加入300μL浓度为MIC的紫草素的孔为实验组，加入300μL去离子水的孔为空白对照组，37℃下继续培养16h。然后吸出每孔中的液体，用PBS缓冲液洗涤2次。阴干后于避光环境下向每孔中加入1mL 5μmol/L的钙离子荧光探针(Fluo-3AM)，于37℃培养箱中孵育45min进行探针装载。吸出剩余的荧光探针染液并用PBS缓冲液冲洗，置于37℃培养箱中继续孵育15min，以确保Fluo-3AM完全转变为Fluo-3。取出盖玻片，用10μL抗荧光淬灭剂进行封片后，利用激光共聚焦显微镜检测荧光强度，并按照公式(1)计算钙离子浓度([Ca2+])变化百分率。实验重复3次。
1.6 紫草素对白色念珠菌分泌胞外磷脂酶(phosphlipase，PL)的影响
制备10μL含紫草素终浓度为1/2MIC和MIC的菌悬液(106 CFU/mL)并用移液枪接种于卵黄培养基上，以加等量PBS的菌悬液为空白对照，于37℃下培养48h。待培养结束后，用刻度尺分别测量平板上的菌落直径和沉淀圈直径，每组实验重复3次，取平均值。磷脂酶的活性用PZ值表示，PZ值按下列公式计算。PZ值=菌落直径/总直径。总直径=菌落直径+菌落周围沉淀圈的直径。PZ=1，表示无磷脂酶活性；PZ值<1，表示有磷脂酶活性，且PZ值越大，磷脂酶的活性越弱。
1.7 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响
1.7.1 白色念珠菌PLB1和PLB2基因的检测: 提取模板DNA，根据GenBank中已发布的白色念珠菌的基因序列，利用Primer 5.0软件及参考文献设计磷脂酶相关基因PLB1和PLB2的上下游引物，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。PCR扩增条件为94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；72℃ 10min。
1.7.2 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响: 将培养至对数期的菌悬液接种到含紫草素终浓度分别为1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培养基中，30℃、150 r/min培养16h后，采用Trizol法提取RNA，用微量核酸测量仪进行RNA浓度的定量。采用2步法反转合成模板cDNA，根据设计合成RT-PCR引物进行扩增。以18SrRNA为内参基因，以不加药物组为空白对照。待反应结束后分析RT-PCR的扩增曲线和融解曲线，并计算PLB1和PLB2基因的相对表达量。
1.8 统计学方法
采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3统计软件进行分析，数值用均数±标准差(x±s)表示。予以卡方检验和t检验。以P<0.05为具有统计学意义。
