来自于供体的组织或细胞在体外进行的首次培养即为原代培养。原代培养的细胞主要特点是生物学特性与在体细胞最为接近。因此，原代培养的细胞可被广泛地应用于药物测试、细胞分化等实验研究中。
组织块法和消化法是两种重要的、常用的原代培养方法。组织块法是将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块，接种于培养瓶中，新生的细胞大约24h后可从贴壁的组织块四周游出并生长。利用组织块法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时，首先可选择组织块法。
结合化学与生化的手段，将已剪切成较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质(基质、纤维等)加以消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，形成含单细胞或细胞团的悬液。冈单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物，经体外适宜条件培养后，可以得到大量活细胞，在短时间内细胞可生长成片，此种原代培养的方法即为消化法。
消化试剂的种类较多，各种消化剂作用的机制各不相同，不同组织可选用不同的消化剂来进行消化。酶是常用的消化试剂，在原代培养中，对于一些间质少、较软的组织，如上皮、肝、肾、胚胎等，选择胰蛋白酶来加以消化可收到较好的效果。胶原酶因其对胶原有较强的消化作用，因此，适合用在对纤维性组织、一些较硬的癌组织等的消化中。上皮细胞对胶原酶的耐受力较强，用胶原酶消化上皮组织，在去除细胞间质、使上皮细胞与纤维成分分离的同时，上皮细胞也不会受到伤害。
除酶以外．在一些组织，尤其是上皮组织的原代培养中，还常用到一些非酶性的消化剂，如。EDTA。上皮组织的完整性有赖于其生存环境中的Ca2+ 、Mg2+，通过吸收、螯合这些离子，EDTA可使上皮组织细胞彼此间发生分离。
【实验用品】
材料：新生大鼠
器材：眼科弯剪、不锈钢筛网(100目)、三角烧瓶、离心管、弯头吸管、注射器、磁力搅棒及搅拌器、10cm培养皿、培养瓶、计数板、倒置显微镜、离心机
【试剂配制】
D-Hanks平衡液
取市售D-Hanks干粉1袋，剪开包装后将干粉溶于适量双蒸水中；在1000ml容量瓶中调节pH为7．2~7．4．并将D-Hanks液定容至。1000ml；将1000ml D-Hanks液分装到数个生理盐水瓶中．每个瓶塞上插入2只注射器针头，55．16kPa高压蒸气灭菌20~30min；从高压锅内取出装有D-Hanks液的生理盐水瓶后，立即拔出针头并在针孔处贴上胶布，以防溶液被细菌污染：4℃保存，使用时可加入青霉素和链霉素双抗溶液，使二者终浓度都达到100U／ml。
DMEM培养基
取市售DMEM培养基，小心剪开包装，将干粉溶于适量双蒸水中，并用适量双蒸水冲洗包装袋内侧面，将溶液定容至[000ml；根据包装袋上的说明添加NaHCO3；调节溶液pH7．4左右：加入青霉素和链霉素，使两者的最终浓度都达到100U／ml；采用0．22μm孔径的滤膜正压过滤除菌并分装培养基：①取出已消毒的微孔滤膜不锈钢滤器；②在不锈钢滤器的上层与下层之间．放置孔径为0．22μm的滤膜，滤膜的光面朝上；③向不锈钢滤器中轻轻加入培养基；④向不锈钢滤器加压；⑤将已经过滤的培养基分装于100ml小瓶中；-20℃保存，使用时再加入10％～20％血清，并再次用上述方法过滤除菌。
胰蛋白酶消化液
将D-Hanks平衡液高压消毒，用NaHCO3液调节pH至7．2左右；称取所需量的胰蛋白酶．加入少量D-Hanks平衡液，搅拌均匀后再补足D-Hanks平衡液，搅拌混匀；将配制的胰蛋白酶液加以粗滤后，再用注射滤器进行除菌及消毒：①打开直径为25mm的注射滤器；②将孔径为0．22μm的微孔滤膜光面朝上放置于滤器中；③将滤器安装在注射器上；④向注射器中加入需过滤的胰蛋白酶液；⑤推动注射器，使胰蛋白酶液经过滤膜过滤；将已过滤的胰蛋白酶液分装成小瓶；4℃或-20℃保存备用。
【实验步骤】
(1) 组织块法(以新生大鼠肝细胞的原代培养为例)：
1)用75％乙醇溶液棉球反复擦拭新生大鼠全身3遍。
2) 将大鼠移人超净工作台后，再用75％乙醇溶液擦拭1次。
3) 断头法处死大鼠，用眼科剪打开腹腔，取出肝组织，置于培养皿中。
4) 用D-Hanks液反复冲洗肝组织3遍，去除血细胞。
5) 为避免杂细胞的污染，需用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除。
6) 将肝组织移人一新的培养皿中，滴0．5ml培养基于肝组织上，用眼科剪将其剪成1／mm3左右的小块，同时用眼科镊将其彼此分升。
7) 用弯头吸管将剪碎的肝组织块吸起，移八培养瓶底部。
8) 用弯头吸管头移动肝组织块，使其均匀分布于培养瓶底部，小块间距控制在0．5cm左右，即25ml培养瓶中放置15~20块。
9) 吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴人，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。
10) 将培养瓶轻轻放入培养箱中培养。24h后镜检。当观察到有少量细胞从组织块周围游离而出时，表明需要补充少量培养基。
(2)消化法(以胰蛋白酶消化为例)：
1)将新生大鼠的肝组织用D-Hanks液漂洗3次。
2)用眼科剪、镊将附着在肝组织上的结缔组织去除。
3)将肝组织剪成1～2mm3左右的小块，置于三角烧瓶中，放人磁力搅拌棒，再注入30～50倍组织量的预热到37℃的胰蛋白酶液。
4)在磁力搅拌器上对肝组织块进行搅拌10~20min。也可将三角瓶故入水浴或温箱中，每5min摇动1次。如消化时间较长，可每隔5min取出2／3上清液移入另一离心管．离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基，然后再给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。若在4℃条件下进行冷消化，消化的时间需延长至12~24h。如果肝组织块在冷消化一段时间后，可离心再添加胰蛋白酶，放入37％温箱中继续温热消化20～30min，效果会较好。
5) 吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，若组织块已分散成小的细胞团或单个细胞，应立即终止消化。
6) 将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过，除掉未消化充分的大块组织。
7) 将收集的细胞悬液800~1000r／min离心3~5rain，去除含胰蛋白酶的上清液。
8) 用D-Hanks液漂洗1～2次，每次800～1000r／min离心3～5min，去除上清液。
9) 加入含10％血清的DMEM培养基，吹打沉淀制悬，按5x105~1x106个／ml细胞的密度接种到培养瓶，于37℃条件下培养。
【结果分析】
(1) 组织块法培养的细胞观察：利用倒置显微镜观察发现，经培养24h的组织块边沿有少量细胞游离出来；随着培养时问延长，组织块周围细胞的数量明显增多。这些细胞的核较大．胞质中内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态介于圆形与多角形之间。
(2) 胰蛋白酶消化法培养的细胞观察：在倒置显微镜下．刚接种于培养瓶中时，细胞是悬浮于培养液中的，细胞形态均呈现为圆形。24h后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展后．重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。48h以后，细胞进入增殖期．细胞数量明显增多，在接种的细胞或细胞团周围可见有新生的细胞，这些细胞因内含物少而较为透明，胞体轮廓通常较浅。96h以后，新生的细胞可连接成片，同时胞体透明度减弱、轮廓增强，核仁明显可见。
【注意事项】
(1) 组织块法中，D-Hanks 液对肝组织的冲洗要充分，尽量去除血细胞，避免其溶血后对肝细胞的生长产生影响。
(2) 组织块的体积应控制在1mm3左右，这样其中心部位的细胞才可获得充足的养分。体积过大的组织块其中心部位细胞常会因营养不足而发生死亡、溶解，由此会对周围细胞的生长产生影响。
(3) 培养瓶中组织块摆放的密度不能过大，否则细胞将会因为营养不足而活性不佳。此外．为了避免组织块漂浮、不贴壁，第一次加入培养基的量要少，而在移动和观察细胞时，动作也要轻，因为培养基的振荡也会影响组织块的贴壁。
(4) 消化法中，因Ca2+ 、Mg2+及血清均具有抑制胰蛋白酶活性的作用，消化过程中使用的所有液体．应均不含有这些离子及血清，消化后可直接加含血清培养基使其灭活。
(5) 在选择消化时间时，应考虑到胰蛋白酶的浓度及pH对消化效果的影响，胰蛋白酶常用浓度为0．25％，pH8．9，消化时温度最好控制在37℃。一般新配制的胰蛋白酶液消化力很强．所以开始用时要注意观察，严格限制消化时间，以免消化过度。
胰蛋白酶主要适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对于纤维性组织和较硬的癌组织的效果差。
(6) 由于原代培养过程较长，因此，应严格进行无菌操作，避免细菌、霉菌等的污染。
